Трансляція є одним з найважливіших процесів молекулярної біології. Вона дозволяє перевести генетичну інформацію, закодовану в ДНК, в поліпептидні ланцюги білків. Однак перед початком трансляції необхідно провести транскрипцію, тобто створити копію генетичної інформації у вигляді РНК - рибонуклеїнової кислоти.
Основним видом РНК, що бере участь в трансляції, є транспортна РНК (тРНК). Вона здатна зв'язуватися з певним амінокислотним залишком і доставляти його до рибосом - місцях синтезу білка. Крім того, тРНК містить антикодон, який визначає послідовність нуклеотидів, комплементарну кодону ДНК.
Процес побудови тРНК по ДНК ланцюга включає кілька етапів. Спочатку необхідно визначити місце розташування гена на ДНК ланцюга і почати транскрипцію, синтезуючи молекулу мРНК. Потім молекула мРНК направляється до рибосом, де відбувається сполучення амінокислот з тРНК за принципом комплементарності антикодону і кодонів на мРНК.
Отримання ДНК ланцюга
Для побудови потрійної спіральної структури ДНК необхідно отримати відповідну ДНК ланцюг. Процес отримання ДНК ланцюга заснований на реплікації, або копіюванні існуючої ДНК ланцюга.
У природних умовах реплікація відбувається всередині клітини при поділі, однак для досліджень в лабораторії може знадобитися отримати ДНК ланцюг самостійно. Для цього необхідні наступні компоненти:
| Компонент | Опис | Функція |
|---|---|---|
| Матрична ДНК ланцюг | Одноланцюгова ДНК молекула, що містить послідовність, за якою буде здійснюватися синтез нового ланцюга | Служить в якості шаблону для синтезу комплементарної ланцюга |
| застосування затискають ферментів | Особливі ферменти, здатні розпізнавати і зв'язуватися з певними послідовностями ДНК | Дозволяють утримувати і фіксувати матрицю ДНК на потрібних ділянках, забезпечуючи точність розпізнавання і синтезу ланцюга |
| Нуклеотиди | Молекули, що складаються з азотистої основи, фосфату та п'ятикутного цукру дезоксирибози | Будівельні блоки, з яких синтезується Нова ДНК ланцюг |
| ДНК-полімераза | Фермент, здатний каталізувати процес синтезу ДНК при додаванні нуклеотидів в комплементарні до матриці позиції | Забезпечує синтез нової ДНК ланцюга і зв'язування нуклеотидів в правильній послідовності |
Синтез ДНК ланцюга здійснюється в якості етапів зазвичай за алгоритмом:
- Підготовка матричної ДНК ланцюга і застосування затискають ферментів для її фіксації.
- Приготування реакційної суміші, що містить нуклеотиди, ДНК-полімеразу та інші необхідні компоненти.
- Додавання реакційної суміші до фіксованої матриці ДНК та інкубація при певній температурі.
- Реакційна суміш і фіксована ДНК ланцюг забезпечують умови для синтезу нової ДНК ланцюга.
- Проведення етапу термоденатурирования для відділення синтезованої ДНК ланцюга від матриці.
- Очищення синтезованої ДНК ланцюга від залишків реакційної суміші, ферментів та інших компонентів.
Таким чином, отримання ДНК ланцюга є ключовим кроком у побудові трнк по ДНК ланцюга і може бути здійснено в лабораторних умовах при дотриманні певних протоколів і використанні необхідних компонентів.
Ізоляція ДНК з клітинного матеріалу
Існує кілька методів ізоляції ДНК, включаючи екстракцію фенол-хлороформу, колонкову хроматографію та використання комерційних китів. Один з найпоширеніших методів - фенол-хлороформова екстракція.
Процес фенол-хлороформової екстракції ДНК включає кілька етапів. Спочатку клітини або тканина піддаються деструкції або лізису, щоб звільнити ДНК. Потім отриману суміш обробляють фенолом і хлороформом, які допомагають видалити білки та ліпіди.
Після цього ДНК осідає, як правило, за допомогою етилового спирту або ізопропанолу. Отриманий осад ДНК можна розчинити в спеціальному буфері і використовувати для подальших маніпуляцій, таких як ПЛР або секвенування.
В процесі ізоляції ДНК необхідно дотримуватися певних запобіжних заходів, так як ДНК може бути лабільна і схильна до руйнування фізичними або хімічними впливами. Для цього рекомендується працювати в стерильних умовах і використовувати спеціальні реагенти і пластиковий посуд, призначені для роботи з ДНК.
Підготовка реакційної суміші
Для побудови трнк по ДНК ланцюга необхідно провести реакцію транскрипції, в ході якої ДНК-ланцюг буде скопійована в трнк-ланцюг. Для цього потрібно підготувати реакційну суміш, що містить всі необхідні компоненти для успішної транскрипції.
1. Взяти добавки і розчини, необхідні для приготування реакційної суміші:
- РНК-полімераза-фермент, що відповідає за синтез трнк-ланцюга
- Шаблон ДНК матриці для синтезу ланцюга трнк
- Буфер-забезпечує оптимальні умови для активності РНК-полімерази
- Нуклеотиди (аденін, гуанін, Цитозин, Урацил) - будівельні блоки для синтезу трнк-ланцюга
- Рибонуклеази-ферменти, що руйнують нерозрізані нуклеотидні ланцюги
2. Підготувати зразки ДНК для реакції:
- Ізолювати цільову ДНК ланцюг з клітинної матриці, використовуючи методи екстракції ДНК.
- Очистити отриману ДНК від домішок і контамінацій, провівши процедуру чищення і концентрування.
- Визначити концентрацію і якість ДНК, використовуючи спектрофотометрію або гелі-електрофорез.
- Розбавити ДНК зразок до потрібної концентрації, використовуючи стандартний буфер.
3. Приготувати реакційну суміш:
- Змішати в пробірці всі необхідні компоненти: РНК-полімеразу, буфер, матричну ДНК, нуклеотиди і рибонуклеази. Слід дотримуватися певної пропорції кожного компонента.
- Ретельно перемішати суміш, використовуючи піпетку або спеціальну міксерну установку, щоб забезпечити рівномірний розподіл компонентів.
4. Інкубувати суміш при оптимальній температурі і часу, що дозволяють провести успішну транскрипцію ДНК.
Готова реакційна суміш підготовлена для проведення реакції транскрипції, в результаті якої буде синтезована тРНК-ланцюг по ДНК матриці. Грамотна підготовка і правильне змішування компонентів важливі для успішного виконання транскрипції і отримання трнк-ланцюга, достовірно відображає інформацію, закодовану в ДНК.
Обробка реакційної суміші спеціальними ферментами
Після отримання ДНК-ланцюга в лабораторних умовах її необхідно обробити спеціальними ферментами для отримання трнк. Така обробка дозволяє зробити ДНК податливою для подальшого синтезу РНК. Для цього використовуються такі ферменти, як РНК-полімераза, РНК-лігаза та РНКази.
РНК-полімераза-це фермент, який здатний синтезувати РНК на основі матричної ДНК. У реакційній суміші додається дана ферменту, яка пристиковується до ДНК-ланцюга і починає синтезувати трнк на основі транскрипційної молекули РНК.
РНК-лігаза-це фермент, який здатний з'єднувати дві окремі РНК-молекули в єдиний ланцюг. У разі синтезу трнк, дана ферменту зшиває окремі фрагменти РНК, отримані в результаті роботи РНК-полімерази, в єдину молекулу трнк.
РНКази-це група ферментів, які здатні розщеплювати РНК-ланцюг. В процесі обробки реакційної суміші трнк-ферментом, РНКази руйнують зайві РНК-фрагменти, які не є частиною трнк. Це дозволяє отримати чистий трнк, готовий для подальшого використання.
| Фермент | Функція |
|---|---|
| РНК-полімераза | Синтез РНК на основі матричної ДНК |
| РНК-лігаза | З'єднання двох окремих РНК-молекул в єдиний ланцюг |
| РНКази | Розщеплення РНК-ланцюга |
Фрагментація ДНК
| Метод фрагментації | Опис |
|---|---|
| Використання рестриктаз | Рестриктази-це ферменти, які здатні розпізнавати певні послідовності нуклеотидів у ДНК і розрізати її на цих ділянках. Таким чином, можна отримати фрагменти ДНК різних розмірів. |
| Сонікація | Сонікація-це процес, при якому звукові хвилі застосовуються для руйнування фрагментів ДНК. Це особливо корисно для отримання випадкових фрагментів однакового розміру. |
| Хімічне фрагментування | При хімічному фрагментації ДНК речовини додаються до молекули, що призводить до утворення розривів у ланцюзі. Це дозволяє отримати фрагменти ДНК різних довжин. |
Після фрагментації ДНК можна перейти до подальших етапів побудови ТРНК, таких як зворотна транскрипція, клонування та секвенування фрагментів ДНК.
Очищення та концентрація фрагментів ДНК
Після фрагментації ДНК необхідно провести очищення і концентрацію отриманих фрагментів для подальшої побудови трнк. Очищені ДНК фрагменти забезпечать більш точні і надійні результати аналізу.
Одним із поширених методів очищення ДНК є фенол-хлороформна екстракція. Для цього суміш ДНК і фенолу / хлороформу перемішується і потім центрифугується. В результаті даної процедури ДНК переходить в органічну фазу, а домішки залишаються у водній фазі. Після цього ДНК витягується з органічної фази і проходить додаткові етапи очищення, такі як спиртова промивка і охолодження.
Концентрація ДНК фрагментів важлива для успішної подальшої ампліфікації та подальшого секвенування. Для цього використовується спектрофотометрія, що дозволяє визначити оптичну щільність зразка і концентрацію ДНК. Чисті і концентровані ДНК фрагменти готові для подальших етапів побудови трнк і подальшого аналізу.
Побудова трнк по ДНК ланцюга
Побудова трнк по ДНК ланцюга відбувається в кілька етапів:
1. Транскрипція: процес, в якому ДНК розділяється на дві окремі ланцюжки, і на одній з них починається синтез РНК.
2. Модифікація РНК: транспортна РНК проходить процес модифікації і готується до зв'язування з амінокислотами.
3. Парне зв'язування: тРНК зв'язується з певною амінокислотою, утворюючи комплекс, готовий до використання в трансляції.
4. Перенесення амінокислоти: комплекс тРНК-амінокислота переноситься на рибосому для складання поліпептидного ланцюга.
5. Термінація та реліз: процес синтезу трнк завершується, коли рибосома досягає стоп-коду і поліпептидний ланцюг від'єднується.
Побудова трнк по ДНК ланцюга є складним і багатокомпонентним процесом, який вимагає взаємодії безлічі білків і РНК. Однак, завдяки точній послідовності нуклеотидів в ДНК, трнк може бути побудований з високою точністю і специфічністю для кожної амінокислоти.