Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) – це метод, що дозволяє ампліфікувати специфічні ділянки ДНК. Вона використовується в багатьох областях науки і медицини, включаючи генетику, діагностику, судово-медичну експертизу та еволюційну біологію.
ПЛР заснована на використанні термостабільної ДНК-полімерази, яка здатна каталізувати синтез ДНК в умовах підвищеної температури. Процес ПЛР складається з декількох циклів, кожен з яких включає нагрівання зразка ДНК, ампліфікацію цільової ділянки та охолодження.
У кожному циклі ПЛР кількість копій цільової ділянки ДНК подвоюється. Початкова кількість ДНК після першого циклу подвоюється, кількість копій збільшується в два рази. Після другого циклу кількість копій збільшується в чотири рази, після третього – у вісім разів, і так далі. Таким чином, кожен цикл збільшує кількість копій цільової ділянки в геометричній прогресії.
Скільки циклів ПЛР потрібно для проведення аналізу?
Кількість циклів, необхідних для проведення аналізу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), залежить від конкретної мети дослідження, а також від вихідного матеріалу, в якому необхідно виявити та збільшити кількість ДНК або РНК.
Основна ідея ПЛР полягає в багаторазовому збільшенні вихідного фрагмента ДНК або РНК за допомогою спеціальних ферментів - термостабільних ДНК-полімераз. Кожен цикл ПЛР складається з трьох етапів:
Денатурація: розділення двох ланцюгів ДНК або РНК під впливом високих температур. В результаті цього етапу утворюється одноланцюговий матеріал, готовий для подальшої ампліфікації.
Відпал (застосування праймерів): праймери (короткі олігонуклеотиди) зв'язуються з комплементарними ділянками цільового фрагмента ДНК або РНК і служать ініціаторами синтезу нового ланцюга при подальшій ампліфікації.
Екстенсія (продовження ланцюга): ДНК-полімераза додає нуклеотиди до праймерів, перетворюючи одноланцюговий матеріал у ДВОЛАНЦЮГОВУ ДНК.
Кількість циклів ПЛР визначається експериментально і може варіювати в залежності від початкової кількості матеріалу і бажаної кінцевої концентрації шуканого фрагмента. Зазвичай проводять від 25 до 40 циклів, хоча в деяких випадках може знадобитися і більше 50 циклів.
Важливо відзначити, що з кожним циклом кількість збільшуваної ДНК або РНК експоненціально зростає в геометричній прогресії, що дозволяє отримати достатню кількість матеріалу для подальшого аналізу.
ПЛР: основні етапи і принцип роботи
Принцип роботи ПЛР заснований на багаторазовому збільшенні певної послідовності ДНК. Для цього застосовуються спеціальні ферменти, нуклеотиди і праймери, які забезпечують точне копіювання і збільшення ДНК.
Основні етапи ПЛР:
- Денатурація. При нагріванні зразок з ДНК розпадається на дві окремі, комплементарні ланцюга.
- Відпал праймерів. Праймери, короткі фрагменти ДНК, зв'язуються з комплементарними ділянками ланцюга ДНК.
- Екстенсія. Синтез нових ДНК-ланцюгів, які є копіями вихідної.
Кожен з цих етапів повторюється кілька разів, що дозволяє значно збільшити кількість певної послідовності ДНК. Після завершення ПЛР отримані продукти можуть бути проаналізовані за допомогою різних методів, таких як гель-електрофорез або секвенування. Це дозволяє дослідникам вивчати генетичні особливості організмів, а також виявляти та уточнювати наявність певних генів або мутацій.
Таким чином, ПЛР є незамінним інструментом у молекулярній біології, який дозволяє швидко та ефективно копіювати та аналізувати ДНК.